一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

?  學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理;

?  掌握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)技術(shù);

?  掌握美析V-1500可見(jiàn)分光光度計(jì)的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。

二、實(shí)驗(yàn)原理

紫外-可見(jiàn)吸收光譜法又稱紫外-可見(jiàn)分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，是以溶液中物質(zhì)分子對(duì)光的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來(lái)的一類分析方法。紫外-可見(jiàn)吸收光譜的產(chǎn)生是由于分子的外層價(jià)電子躍遷的結(jié)果，其吸收光譜為分子光譜，是帶光譜。

進(jìn)行定性:利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜法進(jìn)行定性分析一般采用光譜比較法。即將未知純化合物的吸收光譜特征，如吸收峰的數(shù)目、位置、相對(duì)強(qiáng)度以及吸收峰的形狀與已知純化合物的吸收光譜進(jìn)行比較。

定量分析: 紫外-可見(jiàn)吸收光譜法進(jìn)行定量分析的依據(jù)是朗伯-比爾定律：A=lgI0/I=εbc，當(dāng)入射光波長(zhǎng)λ及光程b一定時(shí)，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比，即物質(zhì)在一定波長(zhǎng)處的吸光度與它的濃度成線形關(guān)系。因此，通過(guò)測(cè)定溶液對(duì)一定波長(zhǎng)入射光的吸光度，就可求出溶液中物質(zhì)濃度和含量。由于最大吸收波長(zhǎng)λmax處的摩爾吸收系數(shù)最大，通常都是測(cè)量λmax的吸光度，以獲得最大靈敏度。

光度分析時(shí)，分別將空白溶液和待測(cè)溶液裝入厚度為b的兩個(gè)吸收池中，讓一束一定波長(zhǎng)的平行單色光非別照射空白和待測(cè)溶液，以通過(guò)空白溶液的透光強(qiáng)度為I0，通過(guò)待測(cè)溶液的透光強(qiáng)度為I，根據(jù)上式，由儀器直接給出I0與I之比的對(duì)數(shù)值即吸光度。

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì):紫外-可見(jiàn)吸收光譜法所采用的儀器稱為分光光度計(jì)，它的主要部件有五個(gè)部分組成，即

由光源發(fā)出的復(fù)合光經(jīng)過(guò)單色器分光后即可獲得任一所需波長(zhǎng)的平行單色光,該單色光通過(guò)樣品池靜樣品溶液吸收后，通過(guò)光照到光電管或光電倍增管等檢測(cè)器上產(chǎn)生光電流，產(chǎn)生的光電流由信號(hào)顯示器直接讀出吸光度A。可見(jiàn)光區(qū)采用鎢燈光源、玻璃吸收池;紫外光區(qū)采用氘燈光源、石英吸收池。

本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白質(zhì)吸收波長(zhǎng)略有差別）。在最大吸收波長(zhǎng)處，吸光度與蛋白質(zhì)溶液的濃度的關(guān)系服從朗伯-比耳定律。該測(cè)定法具有簡(jiǎn)單靈敏快速高選擇性，且穩(wěn)定性好，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。

特點(diǎn)：帶光譜

分子光譜

應(yīng)用：定性分析-最大吸收波長(zhǎng)

定量分析-朗伯-比爾定律（標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法）

根據(jù)朗伯－比耳定律：A=εbc，只要繪出以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)出試液的吸光度，就可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對(duì)應(yīng)的濃度值，即未知樣的含量。

三、儀器與試劑

美析V-1500可見(jiàn)分光光度計(jì)，比色管，吸量管

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：5.00 mg.mL-1溶液

0.9% NaCl溶液，待測(cè)蛋白質(zhì)溶液

四、實(shí)驗(yàn)步驟

<一>準(zhǔn)備工作

1. 啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，打開(kāi)主機(jī)電源開(kāi)關(guān)，啟動(dòng)工作站并初始化儀器。

2. 在工作界面上選擇測(cè)量項(xiàng)目（光譜掃描，光度測(cè)量），本實(shí)驗(yàn)選擇光度測(cè)量，設(shè)置測(cè)量條件（測(cè)量波長(zhǎng)等）。

3. 將空白放入測(cè)量池中，點(diǎn)擊START掃描空白，點(diǎn)擊ZERO校零。

4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

<二>測(cè)量工作

1.吸收曲線的繪制:

用吸量管吸取2mL5.00mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻 度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液為參比，在190 nm～400nm區(qū)間，測(cè)量吸光度。

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ：

用吸量管分別吸取0.5、1.0 、1.5、 2.0 、2.5  mL 5.00 mg.mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm處分別測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A278記錄所得讀數(shù)。

3. 樣品測(cè)定：

取適量濃度的待測(cè)蛋白質(zhì)溶液3 mL，按上述方法測(cè)定278 nm處的吸光度。平   行測(cè)定三份。

五、數(shù)據(jù)處理：

1. 以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸收曲線，找出最大吸收波長(zhǎng)。

由吸收曲線可得最大吸收波長(zhǎng)λmax=278nm(圖略)

2. 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

濃度C-吸光度A標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是：A=0.6208*C+0.0186

曲線擬合優(yōu)度:   R2=0.9998

3. 根據(jù)樣品蛋白質(zhì)溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。

所測(cè)溶液平均濃度:    C=(C1+C2+C3)/3=1.056 mg/mL

測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差：      =0.003

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差：       =0.284%

待測(cè)蛋白質(zhì)溶液濃度為：1.056 mg/mL*10mL/3mL=3.520 mg/mL。

六、思考題:

紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？受哪些因素的影響和限制？

優(yōu)點(diǎn)：該測(cè)定法具有簡(jiǎn)單靈敏快速高選擇性，且穩(wěn)定性好，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。

缺點(diǎn)：儀器昂貴，而且不同的蛋白質(zhì)的紫外吸收是不相同的，測(cè)定結(jié)果存在著一定的誤差。

七、注意事項(xiàng):

1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，蛋白質(zhì)溶液濃度要準(zhǔn)確配制，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液;

2.測(cè)量吸光度時(shí)，比色皿要保持潔凈，切勿用手玷污其光面;

3.石英比色皿比較貴重，使用時(shí)要小心。